诺奖级科研成果在眼前却被忽略,奥秘何在? | 科学春秋
christian b. anfinsen 图源：nobelprize.org
编者按：
1972年，美国科学家克里斯蒂安·b·安芬森（christian b. anfinsen，1916.3.26-1995.5.14）因“对核糖核酸酶的研究，特别是对其氨基酸序列与生物活性构象之间的联系的研究”获得二分之一诺贝尔化学奖。美国著名的生物化学家、生物物理学家david s. eisenberg在一篇文章里回忆，anfinsen开创了近代蛋白质折叠研究的新时代的著名实验在其之前就被耶鲁大学教授frederic richards的学生lisa steiner做过了，但当时谁也没有当回事，甚至觉得不值得发表。实际上，1959年中国科学家人工合成胰岛素与anfinsen的实验也极为相似。为什么这些科学家过科学圣殿之“门”而没入呢？本文讨论了其中的奥秘。
撰文 | 王志珍（中国科学院生物物理所研究员）
责编 | 程 莉
最近一位美国朋友与我谈起他刚在cell上看到的一篇文章，讲美国耶鲁大学医学院一个女研究生早在诺贝尔化学奖得主christian anfinsen之前就做过核糖核酸酶的变性和自复性，其实验内容和结果与anfinsen的实验基本一样。我听了非常吃惊，以前从来没有听说过。
核糖核酸酶的变性和自复性实验
学过生物化学的人应该对anfinsen经典的核糖核酸酶变性和自复性实验（图1）都有印象。牛胰核糖核酸酶a能够被高浓度尿素和还原剂-巯基乙醇彻底地变性。还原剂打开了核糖核酸酶分子内部4对二硫键的共价连接，尿素破坏了维系蛋白质结构的疏水相互作用，从而将酶从其稳定结构变性为伸展的多肽链。蛋白质的结构是其活性和功能的前提，所以完全伸展的核糖核酸酶多肽链彻底丧失了催化活力。但是，当从反应体系中去除尿素和还原剂后，完全变性的多肽链会自发地重新折叠形成天然的构象，同时恢复其催化活力。在这个复性过程中，酶分子的8个半胱氨酸残基必须形成其天然构象中原有的4对二硫键。从数学概率计算，8个半胱氨酸残基随机配对形成4对二硫键的组合共有105种，形成天然构象中的4对二硫键形式的概率是1/105。在anfinsen这一实验中，多肽链没有依靠任何其他辅助因素就找到了这1/105可能的天然构象，说明尿素破坏的蛋白质分子内部的弱相互作用对二硫键的正确形成以及天然构象的实现至关重要。正是基于这一经典实验，anfinsen提出了“the amino acid sequence of a polypeptide chain contains all of the information for its three dimensional structure”（多肽链氨基酸序列含有其三维结构的全部信息），即我们说的“一级结构决定高级结构”的著名论断，并因此获得1972年诺贝尔化学奖。anfinsen的工作开创了近代蛋白质折叠研究的新时代，这个著名实验早已载入世界上多本经典生物化学教科书。
图1 anfinsen 核糖核酸酶变性与自复性的实验示意图
是谁在anfinsen之前就做过这一实验？
这个经典实验竟然在anfinsen之前就有人做过了？！我立即去读了6月28日cell上leading edge stories 栏目发表的文章“how hard it is seeing what is in front of your eyes”。
作者david s. eisenberg是美国著名的生物化学家、生物物理学家，他是加利福尼亚大学洛杉矶分校化学与生物化学系教授，霍华德休斯医学研究所研究员，美国科学院院士和美国艺术与科学学院院士。他的研究揭示了蛋白质错误折叠形成淀粉样沉淀的结构基础。
在这篇文章里，eisenberg回忆起1995年7月参加advances in protein chemistry杂志一年一度编委午餐会的情形。当时，同为编委的anfinsen因为在两个月前去世首次缺席。怀着对anfinsen的思念和对他的实验的兴趣，作者问起邻座的frederic richards，当anfinsen在做核糖核酸酶的变性和自复性实验时他在思考些什么。frederic richards是耶鲁大学分子生物物理与生物化学系教授、创系系主任，也是美国科学院院士和美国艺术与科学学院院士，他标志性的工作是1967年测定了核糖核酸酶的晶体结构，这是美国第一个、全世界第三个解析的蛋白质晶体结构。richards的回答把作者吓了一大跳，“当时我没有什么太多的想法，因为我的学生在更早的时候就做过一模一样的实验”，但是这个工作“没有发表，我们当时认为并不值得发表”。
午餐会一周后，eisenberg收到了richards的来信，重申了他的学生lisa steiner在anfinsen第一篇论文发表之前就完成了核糖核酸酶a的变性复性实验，只是写好的毕业论文到1959年才最后提交。信中附上了lisa steiner毕业论文中记录关键数据的几页和他们的结论：“air oxidation of fully or partially inactivated protein resulted, in some cases, in the recovery of up to 40% of the enzyme activity which had been lost as a result of reduction.”（“还原引起部分或完全失活的蛋白质通过空气氧化有时可恢复高达40%的酶活力。”）
几年后eisenberg与已经是美国麻省理工学院生物系免疫学教授的lisa steiner相识，聊起了她那篇毕业论文。原来早在1956年夏天，lisa就开始在richards的指导下开展了核糖核酸酶a的变性复性课题的研究工作。作者问起lisa看到anfinsen文章时的感受，她说，“我很高兴他们发现了和我一样的结果”。当被问到她怎么看待anfinsen因为新的发现（她甚至先于anfinsen就看到了类似的实验现象啊！）而获得无数的荣誉和奖励时，lisa没有表现出丝毫的自怨和苦涩，“事情就应该是这样的。anfinsen理解了这个发现背后的意义，而我们没有”。虽然与蛋白质折叠的重要发现失之交臂，但这并没有影响lisa后来的职业生涯，她成为了美国麻省理工学院生物系历史上聘任的首位女性教授。
richards在给eisenberg信中最后写道，“it’s an amusing example of how hard it can be to see what is in front your eyes!（这是个有趣的例子，看见就在你眼前的东西多么不容易！）”
而eisenberg陷入了深深的疑问，怎么可能这样？
richards是一位思维清晰的、善于表达、那么具有创造力和科学进取心的科学家，他为什么没能发表那些结果呢？其实不仅仅是richards没有意识到这是一项诺奖级别的发现，当时耶鲁生物物理与生物化学系的系主任joseph fruton，也是当时数本最权威的生化教科书的主要作者，在评阅steiner毕业论文时也只是修改了thioglycolic acid的拼写。
胰岛素人工合成中蕴含的蛋白质折叠问题
差不多同一时间，一个类似的研究工作在地球另一端的中国进行。人工全合成具有全部生物活性的牛胰岛素一直是中国引以自豪的代表性成果。1958年，在大跃进的高潮中，中国最优秀的生物化学家和有机化学家们确定了向国庆10周年的献礼项目“合成一个蛋白质——胰岛素”。当时国际上已经有了合成不同长度肽段的经验，但还没有合成蛋白质的先例，特别是由2条肽链组成、并含有多对二硫键的蛋白质的先例。经过讨论最后选定了在当时的知识和技术条件下唯一可行的方案，即先分别合成a链和b链，再把2条链重组成胰岛素分子。
这个方案的关键是a、b 链能否重组成有活性的胰岛素分子。35岁的邹承鲁带着几位大学毕业不久的年轻同事承担了胰岛素拆合的工作，就是把天然胰岛素拆成a和b链，研究能否把分开的a和b链重组成天然胰岛素。这实际上是一个极其复杂的事情（图2）。
图2胰岛素a链和b链拆合实验示意图
（仅列出一条a链和一条b链可能的15种氧化重组模式）
a链有4个半胱氨酸残基，b链有2个半胱氨酸残基，理论上这些半胱氨酸残基在溶液中可以自由地、随机地氧化而生成二硫键。假定溶液中仅有一条a链和一条b链，可能的氧化重组模式就有15种，其中仅一种为天然分子的配对方式，也就是说生成天然胰岛素的概率为6.7%。随着溶液中a链和b链数目的加大，a链与a链之间，b链与b链之间，a链与b链之间，可能的连接方式的数目将呈现指数级的增长。所以二硫键可能的连接方式有无穷多种，在理论上从溶液中分离的a链和b链是无法重组得到天然胰岛素的！
但是邹承鲁团队居然在1959年就把重组胰岛素的活力恢复到了10％！生化所曾向科学院党组申请尽快发表重合成的成果，但由于当时德国zahn和美国katsoyannis的两个研究小组也在进行胰岛素合成的研究，基于对竞争对手的防范，中国的这个结果是必须保密的，党组没有同意生化所的要求。
一直到1960年，dixon和wardlaw在nature上报道了还原的胰岛素a链和b链共同氧化得到1-2%的胰岛素活力恢复之后，他们才于1961年10月在《中国科学》复刊后的第一期上发表了活力恢复达到10%的结果。以后他们又不断改善重组条件，使活力恢复达到以b链计算的30%。1966年4月，“文革”前夕，王应睐、邹承鲁应邀参加在华沙举行的第三届欧洲生化学会大会，邹承鲁缩短了自己的报告时间，让给胰岛素合成的主要参与者龚岳亭（尽管会前提交了胰岛素合成的论文，但龚并没有被邀请做报告）报告胰岛素合成的工作。这引起了因胰岛素蛋白测序获得诺贝尔化学奖的frederick sanger的极大兴趣和高度赞誉。他说这是一项重大的工作，也释放了他思想上的负担，因为曾有人报道与他测定的牛胰岛素序列的差异，所以中国人的工作是他测定的牛胰岛素序列的有力证据。
邹承鲁团队成功完成了胰岛素a、b链拆合的先导性工作，解决了合成的路线问题，而且保证了化学合成的a链和b链以高产率重组成活性胰岛素分子。其实胰岛素a和b链重组的实验与anfinsen的实验非常相似，后者是将变性的、4个二硫键全部还原的核糖核酸酶肽链重新氧化折叠恢复活力。核糖核酸酶只有一条肽链，其4个二硫键的所有组合方式亦仅有105种可能性；而胰岛素则是由2条肽链组成，2条肽链可能以不同的比例与方式组合，其6个巯基所有的可能组合方式则是无穷多。与单肽链的核糖核酸酶相比，胰岛素的复性问题要复杂得多。中国小组所得到的10％的活力恢复结果，在本质上远远超过二硫键随机配对的几率。这使他们当时就得出了“在所有可能的重氧化产物中，胰岛素结构还是一种比较稳定的结构，甚至在各种ab异构物之中，还是最稳定的结构之一”的重要结论。
不幸的是，由于此工作的任务导向性加上“文革”的种种干扰，胰岛素人工合成工作中初放的蛋白质折叠问题的硕大蓓蕾却没有及时绽放。直到70年代末改革开放后，探讨胰岛素拆合成功的基础研究才在北京的中科院生物物理研究所扬帆启航，开展了“胰岛素a、b链相互作用的研究”，进一步总结出胰岛素分子折叠的观点，发表在trends biol. sci上：“胰岛素a、b链本身已经具有一定的结构，含有形成天然胰岛素正确结构的全部信息，能在溶液中相互识别和相互作用从而导致三个二硫键（二个链间二硫键和一个链内二硫键）正确配对，形成结构最稳定的天然胰岛素分子”，阐明从人工化学合成的胰岛素a链和b链生成天然胰岛素分子的蛋白质折叠规律，揭示了人工合成胰岛素中a、b链重组成功的理论基础。
不畏浮云遮望眼，只缘身在最高层
回到前面eisenberg的问题，为什么frederic richards这样的顶尖科学家没能发表他与anfinsen类似的工作？蛋白质科学研究的先驱john t edsall给出了他的答案，解释了为什么聪明的科学家也可能看不见他眼前的东西。edsall是哈佛大学医学院、生物系教授，美国科学院院士，美国艺术与科学学院院士，也是anfinsen、eisenberg和richards共同的导师，最早提出疏水相互作用在稳定蛋白质结构中的作用。
lisa在耶鲁的那个时期（1956-1959），最火热的科学问题是生物遗传信息如何从基因传递到蛋白质。1955年发现了核糖体，1956年发现了trna，1958年crick提出了他的中心法则，1961年解析了遗传密码。当anfinsen开始他的蛋白质折叠的工作时，生物合成和遗传密码已积累了大量新的发现。显然，合成完成的多肽链带着由遗传密码指定的序列，像一条弯弯扭扭的链条从核糖体释放出来，也就是一个变性的蛋白质，它必须找到一条途径，在分子伴侣的帮助下或靠它自己，达到其特有的三维结构。自然界如何复制正确序列的问题已经基本解决了，所有这些发现必然导致对蛋白质折叠问题的格外关注。所以能提出“dna的一维信息如何决定蛋白质的三维结构”这个问题的科学发展背景只能是1960年代早期而不能是1950年代的中期。解决这个问题需要一种新的思维。anfinsen经过一系列研究工作逐渐发展的新理论“热力学假说（thermodynamic hypothesis）”就在这一时间应运而生。就如anfinsen在他的诺贝尔奖获奖演说中描述的那样：“一个天然蛋白在其生理环境中……的三维结构是整个系统的gibbs自由能最低的结构；也就是说，蛋白质在特定环境下的天然构象是由组成它的所有原子相互作用的总和决定的，换言之是由其氨基酸序列决定的。”
设想这样的场景：lisa steiner在她刚走上科研道路之时就看到了一扇门，但是由于当时科学的发展还不足以让她，还有她的导师和系主任，意识到这是一扇特别重要的门，到了它的面前，却又自己离开了；邹承鲁等人在用他们选定的策略执行一个特定任务的路程中必然会看到这扇门，他们也到过它的面前，感觉到它的神秘性，但由于任务的催促和种种其他原因也被带离了，没有去敲开这扇门。而恰恰是在科学发展到遗传信息传递的分子生物学中心法则基本成形的背景下，anfinsen对科学问题的自由探索导致他有目标地寻找一座藏着“dna的一维信息如何决定蛋白质的三维结构”秘密的圣殿，这时他对这扇圣殿的“门”会特别敏感，创造性地运用 “热力学假说”，一旦确定了圣殿的大门，就竭尽全力打开它，继续寻找藏宝的殿堂，直至找到圣宝。
是啊，科学发现往往不会是所见即所得。我们科学家需要聚精会神的心态和一双明亮的眼睛去仔细观察实验结果，但更重要的是能够进一步洞察发现的现象后面的实质性的规律，也就是科学问题的本质。我们每一个人不是总可以做到的。所以fred richards说要看见就在你眼前的东西是多么难啊。
后 记
写此文让我又回忆起我1995年在德国做访问研究时的一件事。在gottingen很容易在图书馆及时看到刚刚出版的杂志。我就是在本文所述的advances in protein chemistry这本蛋白质研究的权威性综述丛书的第47卷上，读到了j. t. edsall教授的文章“hsien wu and the first theory of protein denaturation （1931）”【“吴宪与第一个蛋白质变性理论（1931）”】，它对吴宪教授的学术成就给予了极高的评价。该刊还同时重新全文刊登了吴宪教授1931年用英文发表在《中国生理学杂志》（chin. j. physiol. 5:321-344）的关于蛋白质变性的论文：“study on denaturation of proteins. xiii．a theory of denaturation.”（蛋白质变性研究xiii.变性的理论），也就是说把一篇1931年在中国杂志上发表的论文在六十四年后再次全文刊登在国际一流的丛书上，不能不说是一件罕见的科学奇事。edsall的这篇文章确认第一个蛋白质变性理论是1931年由中国科学家吴宪首先提出的。
时光再回到1995年的波士顿，advances in protein chemistry的编委午餐会正好遇上少有的又闷又热、难于呼吸的天气，edsall教授 92岁，却乘地铁去参加这个重要会议，会后被eisenberg说服打车回家。90多岁还是要相信自己，要有勇气去做力所能及的事情。
感谢中国科学院生物物理所王曦副研究员对此文的完成提供的建议和帮助。
