法国专家公开批评李红良，武大尚无音讯
►《分子治疗》刊发基因治疗专家的评论，对李红良的猴子实验再发质疑
撰文 | 叶无言
责编 | 陈晓雪
●●●
针对李红良的猴子实验，本不期待再有任何严肃讨论出现。
[1]，6位美国基因治疗领域的专家感到失望。“我们提出批评，他却回复了一堆垃圾。” 其中一位专家事后说道。他们认为，不值得再为此浪费时间。
不料，2018年9月18日上线的《分子治疗》（molecular therapy）刊发评论 [2]，又有一位基因治疗领域的专家发表了批评意见。
魔鬼藏于细节
文章作者为法国基因治疗专家federico mingozzi博士，主要研究腺病毒相关病毒（aav）与免疫系统的相互作用，也做aav载体的基因疗法的临床前和临床开发 [3]。
与此前6位美国专家的看法一致，mingozzi博士强调为何要做中和抗体筛查，以及为什么再次给药是徒劳的：
“由于人类和非人类灵长类动物（nhp）暴露于野生型aav，它们通常携带抗衣壳中和抗体（nabs），可以与用于基因转移的几种不同的血清型交叉反应。此外，在载体给药后，就很快产生大量的抗aav中和抗体，而且会一直存在体内数年，因此也导致无法再次给药。”
李曾在首次给药7周后，对50只实验猴进行过四肢周围静脉的注射。虽然，在答复中，李承认“至少不会有坏处”，但依然很难理解为何“大动干戈”做这样的无用功。
除了这些基本问题，mingozzi博士进一步指出，由于各种原因，包括给药途径、载体剂量和制法，aav载体对中性抗体的易感性不尽相同，因此，“对于确保在临床前和临床研究中结果的准确阐释，明确定义基因转移的基本免疫学参数是重要的。”
显然，mingozzi博士认为还存在诸多疑问。
李在给美国6位专家的回复信中称，实验猴是经过仔细预筛选过抗aav8中和抗体的，没有刊登筛选结果是因为“不觉得有必要报告这些数据。” 但mingozzi认为，虽然这可以是一个合理的陈述，但鉴于中和抗体的浓度与基因转移效率相关，建议还是要指明用于预筛选动物的方法和测量实际中和抗体浓度的方法。
mingozzi进一步指出，似乎选出来用在研究中的猴子的中和抗体浓度上限为1:10，高于血清阴性动物所含中性抗体的上限值，尽管李没有提供用于筛选的检测方法的灵敏度的详细信息。
此外，李没有报告第7周载体重新给药时，测量的中性抗体浓度，“尽管事实上，在这种情况下，知道中和抗体的浓度对于了解载体重新注射成功与否非常有用”，mingozzi在评论中写道。
最后，mingozzi提醒，“将基因转移方法从小型动物转移到大型动物和人类，研究人员应仔细考虑aav载体的免疫反应。这种考虑不仅限于衣壳，还涉及使用像gfp（绿色荧光蛋白）这样的报告转基因，绿色荧光蛋白在小鼠中是耐受的，但在灵长类动物中可以具有高度的免疫原性。”在李的猴子实验中，没有任何的免疫原性的评估。
令人生疑的学术调查
加上这位法国专家，围绕着筛查和重复给药，公开质疑李红良《自然医学》论文的专家已经有9位。
回顾事件发展，在本刊首次披露李红良两篇《自然·医学》论文涉嫌造假，当时的质疑仅说，猴子实验周期不够，基因治疗并非通过肝脏门静脉注射。武汉大学在1月29日发布结论，认为李的团队“不存在学术造假”。
做出这一结论的学术依据是该校前后两次组织的学术调查。第一次是2017年12月8日，武汉人民医院组织了5人专家组，包括了3名校外院士。第二次是1月26日，武汉大学学术委员会组织的会议，请了校内校外专家各7名。
根据武汉大学公布的信息，校内专家包括学术委员会主任、院士李德仁，3名副主任（含1位同行院士），1名校学术委员会同行院士，2名校内同行专家。校外的同行专家有7人，包括了2名院士。如此，14人的调查组有5位院士，4位同行院士，凸显了“权威性”。
但此后，事件的发展已经远远超出当初的认知，包括新的是否进行了筛查和重复注射问题。那么，调查组专家当初注意到这些问题了么？在9位国外基因治疗领域的专家公开质疑后，他们还会维持之前的结论么？因为他们应该查看了李实验组的全部原始实验记录，应该是最有可能回答这些问题的人。
遗憾的是，与之前的迅速反应形成鲜明对比，迄今为止，武汉大学仍然保持沉默。
与此同时，基因治疗领域的专家已经不太愿意继续“学术”讨论。当然，这并不是说李的回复打消了他们的疑虑。相反，是他们看到李的回复后，失去了继续与之讨论的兴趣。
以下是笔者收到的几条评论：
“我们这些作者认为我们的目的已经达到了，不想继续纠缠下去。以后大家都会注意这些决定实验成败的关键细节。the devil is in the detail（魔鬼藏于细节）。是非曲直，自有公论。”
“在我看来，你不会改变这个人的道德。不过，我相信至少警告的作用起到了，审稿人将来会更加慎重检查他的研究。要是我的话会做一些更有意义的事，而且总会有像这样的应该从领域内清除出去的人。他的自我傲慢将来某天会让他自食其果，我建议不要浪费你们的时间，因为任何用aav做猴子实验的不用想都知道，不能向他宣称的那样做重复给药。讽刺的是，他不再认同之前的做法，暗示（重复给药）或许不起作用，典型的说谎，自相矛盾。”
“我们也看到了李红良教授的回复信。首先想说明我们写给《自然医学》那封信的目的并不是针对某个实验室，而是就事论事。因为现在采用aav基因载体开展动物实验和临床试验的实验室越来越多，我们在这个领域工作了几十年，想让大家了解aav基因载体在动物实验方面应该注意的问题，以免误导实验结果。
预存抗体在放养动物和人群中是非常常见的，这些抗体无疑或多或少会中和aav病毒颗粒，从而降低甚至完全阻断其介导的基因递送。这个现象在通过血管注射时甚为显著，因为抗体在血液中大量存在。但是，在免疫相对隔绝的组织，譬如大脑和眼底，抗体含量很低甚至缺失。另外，如果通过肌肉注射，注射部位病毒浓度相对较高而抗体含量相对较低，不足以有效阻断基因转导。
值得强调的是，第一次注射aav载体之后，体内中和抗体会大量产生，从而导致重复注射几乎不可能，特别是血管注射。随着越来越多的临床试验出现了令人振奋的结果，为了解决更多病人能接受aav基因治疗和以后重复给药的问题，如何消除预存抗体和阻断中和抗体的产生，已经成为基因治疗领域一个非常重要和挑战性很高的课题。幸运的是，佛罗里达大学barry byrne教授已经率先在这方面取得了突破性的进展。他的团队在小鼠，猴子和人临床试验中，首先发现用cd20抗体清除ｂ细胞，加上雷帕霉素免疫抑制，可以有效防止aav中和抗体的产生，因此，这个重大成就奠定了今后如何应对中和抗体的基础，为更多的新技术的出现创造了一个良好的开端。”
“我支持肖卫东，高光坪等在今年6月《自然医学》和mingozz博士在最新一期《分子治疗》中对李的质疑，也支持之前霍文哲对李学术不端的指责。因为对李红良的工作和学术作风不以为然，已经有先入为主的心判，所以担心评论会有所偏颇。很抱歉我不能对此发表我的评论，谢谢。”
参考资料以及补充说明
[1]
[2] aav immunogenicity: a matter of sensitivity, https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2018.09.001
[3]federico mingozzi之前是巴黎第六大学的副教授，曾在法国国家健康和医学研究所担任主管，目前就职于法国的genethon和美国spark therapeutics，两家进行基因治疗产品研发的机构。
制版编辑 | 皮皮鱼
躲藏水底下的，就看你能憋多久