开荒者许悦：好运在第366次降临 | 科研外史
进入前人没有踏足过的荒地，对于胆小者而言是前途未卜避犹不及的穷山恶水，但对于真正的勇者，却是大展身手封狼居胥的良田沃土。
北京生命科学研究所邵峰博士实验室的许悦博士，在六年半曲折的博士生涯中，在几次实验遇到瓶颈之时都没有轻言放弃，最终攻克了天然免疫学领域内异源自噬的重要问题。本文讲述了许悦博士自2013年到2019年间的研究历程，与读者分享她在科研道路上的探索故事。
撰文 | 黄宇翔
编辑 | 金庄维
寻宝（2013.3-2014.4）
366-c7突变体的发现，是整个故事的开始。 许悦博士
当许悦在2013年3月定导于北京生命科学研究所邵峰博士实验室时，没有什么人能想到这个外表文静低调的北京姑娘有一天能攻克天然免疫学领域内异源自噬的重要问题。
“安静专注而坚韧的小女孩，有时让你感觉不到她的存在。”这是她在高中生物学老师张慧心目中留下的印象。也许正是这种品质，帮助她在六年半曲折的博士生涯中，在几次实验遇到瓶颈之时都不轻言放弃，最终守得云开见月明。
彼时在天然免疫学领域，异源自噬（xenophagy）正是一个火热的话题。长久以来，人们一直认为健康的“守卫部队”——免疫系统——专职负责保护机体抵抗病原菌的侵袭。但在2004年，两个研究团队独立地发现了一个有趣的现象：一些原本被认为手无缚鸡之力的正常组织细胞，在面对凶恶的入侵病原菌面前，并不会坐以待毙，而是会成立“敌后武装”，在细胞内将入侵者包围住，送往细胞内的“垃圾回收站”溶酶体中进行清除处理。研究者将这种宿主细胞通过将入侵病原菌包围并清除的过程称作异源自噬。
到了2012年前后，《自然》、《科学》等顶级期刊上连续发表几篇论文，找到了一些可能参与宿主细胞在实现对入侵病原菌进行“垃圾的分类回收”过程调控的分子，提出宿主细胞能在病原菌蛋白上插上一种叫做“泛素”的标签，将其标志为“有害垃圾”，进而送往垃圾处理场进行销毁[1-3]。
北京生命科学研究所的邵峰团队，长期关注病原菌的致病机制与宿主细胞的免疫抵抗，所以他们自然不会放过这条宿主细胞的抵抗通路。
经过仔细地阅读异源自噬方面的文献报道，邵峰实验室的师生们敏锐地关注到当时几篇热门研究存在漏洞：
首先，尽管在研究者普遍认为泛素化修饰是触发异源自噬的关键步骤，但当时还没有任何团队报道鉴定出介导此过程的泛素底物或泛素连接酶；
其次，当时研究异源自噬的实验体系存在缺陷：细胞只会对不足20%的入侵细菌产生自噬响应。由于好的体系对阐释清楚具体的机制至关重要，因此在自噬响应率如此低的体系下作出的结论有多扎实可靠，是需要被质疑的。
2013年的春天，负责指导新生许悦做实验的博后师兄陆秋鹤在探索异源自噬机制过程中发现了一个现象，而这个观察可能是许悦此后一系列研究发现的源头。
细胞有一套垃圾回收的机制，比如当细胞内的“发电站”线粒体使用寿命达到淘汰标准时，细胞能有一套将其送到垃圾回收站，将其分解为能被细胞二次利用的能量物质，这个细胞内部变废为宝的过程称作细胞自噬（autophagy），在2016年被授予了诺贝尔生理医学奖。转录因子tfeb在细胞自噬的过程中发挥了一个传话员的职责，它在闲暇的时候会待在细胞质中游荡，一旦细胞有了进行细胞自噬的需要，它就会接到上级领导mtor通路的命令，进入到细胞核里，结合在一系列编码细胞自噬效应分子的基因上游，通过转录激活作用，“叫醒”休息中的垃圾回收站工作人员，催促他们尽快到岗。
陆秋鹤博士发现，在异源自噬激活时，能观察到明显的tfeb入核行为，说明这个细胞内在“垃圾回收”过程中负责传令的转录因子，在集结兵力对抗入侵病原菌的过程中可能也发挥了作用。
经过进一步的实验，陆秋鹤发现细胞在异源自噬情景下，很可能不是mtor通路调节tfeb入核。于是，他继续找寻宿主细胞中激活tfeb的机制。
一个金矿出现在了眼前：细菌的哪些成分触发了宿主细胞的tfeb转移入核呢？
换句话说，邵峰团队想问的科学问题是，当病原菌入侵进入细胞后，是病原菌中的哪些成分触发了“警报”，导致tfeb这个传令官得到了讯息，继而快马加鞭奔入细胞核？
图 1. 细胞中的垃圾处理机制。左图为细胞自噬的示意图，表示细胞如何将自身产生的“可回收垃圾”进行分解，变废为宝；右图为异源自噬的示意图，表示宿主细胞面对“有害垃圾”病原菌的入侵，如何奋起反击。（图源：huang et al., (2014) nature reviews microbiology）
但是，面对一整片待开垦的处女地，该如何下手研究呢？
“当研究没有什么头绪的时候，就去做个筛选吧。”邵峰老师对博士选题还没有方向的一年级新生许悦说道。
在眼睛看不清周围景物、找不到研究的明确目标时，做一个遗传学筛选，就像是撒出一张大网，有可能会打开新的局面。
邵老师建议许悦在被异源自噬领域普遍使用的沙门氏菌中进行遗传学筛选。具体来说，就是通过一种来自于噬菌体神奇分子工具——转座子，能随机插入沙门氏菌基因组中，进而极大概率破坏某个基因的功能。如果能找到这样一株细菌突变体，侵染细胞后不再能引起“传令官”tfeb入核，那么这株突变体就很可能是编码能触发tfeb入核的效应分子的基因发生了突变。假如能鉴定出这个基因，就有希望顺藤摸瓜阐释清楚细菌触发异源自噬警报的机制。
同时，细菌的遗传学筛选，对于一个缺乏经验的博士一年级新生而言，确实是一个不错的选择：
首先，在当时，细菌的遗传学筛选远远简单于哺乳细胞的遗传学筛选，这是因为不同于双倍体的哺乳动物细胞不同，细菌细胞是单倍体，只需要破坏单个基因就能够实现完全的基因敲除。而且，与哺乳细胞不同，细菌编码的基因在基因组中排列紧密，且没有内含子，意味着随机的插入有更高的概率破坏基因的功能；
其次，邵峰实验室在细菌遗传学筛选方面拥有丰富的经验，因此新手能从师兄师姐那里得到实验细节方面更多的指导和帮助。
基于此，许悦在邵老师的指导下设计了这样的一个遗传筛选：在人的细胞系中稳定表达一个融合红色荧光蛋白的tfeb，用细菌遗传突变体库对其进行侵染，在高通量显微镜下寻找能让传令官tfeb沉默停留在细胞质不入核的细菌突变体。
此外，邵老师想到一个有意思、但有可能不存在的假设，沙门氏菌引发自噬的比例这么低，会不会存在抑制异源自噬的蛋白呢？考虑到筛选tfeb的同时加入另外一个荧光标记gfp-lc3对于整个筛选并不会增加过多的工作量，邵老师建议许悦在设计实验时同时筛选tfeb与lc3两个表型。
后来的实践证明，他们有心栽花所种下的试图寻找tfeb入核的细菌触发因子的尝试并没能开出花朵，但是无心插柳的另一个表型筛选，却历经曲折，最终结出了丰硕的果实。
筛板子，是一项工作量不算轻的任务。
许悦将人细胞系培养在96孔板——96孔板是一块手掌大小的塑料板，其中包含了96个互相独立的豌豆大小的小孔，将好像是为细胞提供了96间独立的公寓一样。
同时，她还需要将一个个独立的沙门氏菌突变体接种于96孔板，待细菌培养至合适的状态后，一一对应地去感染细胞。沙门氏菌会快速进入细胞，在短短两小时内就可以观察相应的表型。随后许悦将整块96孔板在高通量显微镜下进行拍摄，监控每一个独立“细胞公寓”中传令官tfeb的入核以及异源自噬通路整体激活的水平。
每一批板子，从培养细菌铺细胞，到最后在显微镜下拍摄获得原始数据，一整套流程下来需要两天时间。刚开始对于许悦来说，一次只能完成五块板子。渐渐熟练之后，一次实验可以操作十块96孔板。
加上摸索实验条件的时间，半年很快就过去了。许悦已经筛完了预计的300个96孔板（每块板中实际可以筛选58个沙门氏菌突变体），看过了将近两万个细菌突变体侵染宿主细胞的表型，除了发现很多影响细菌侵入细胞的突变体外，其他一无所获。沙门氏菌共编码4672个蛋白，考虑到转座子的插入不一定会破坏基因的功能和筛选的随机性等因素，目前检测的300个板子并不十分保险。
“我再筛100个板子吧，如果还是筛不到，我们再想别的办法。”许悦认为好不容易建立起的筛选体系，这样放弃有点可惜，于是跟邵老师建议道。
好运终于在筛选的第366块板子上降临。
图2. 幸运的第366块板子。许悦在沙门氏菌上开展的转座子遗传筛选示意图，前365块板子一无所获，但上天终于在她筛到第366块板子时眷顾了她。
2014年2月13日，刚刚过完春节。许悦已经开始在高通量显微镜下拍摄新年后的第三批样品了。
tfeb的信号如往常一样，在细菌的侵染下纷纷入核，看来又都是阴性的结果。
但是，当她将显微镜切换到绿色通道时，一个散发出一簇簇亮眼荧光信号的小孔立刻吸引了她的眼球——与绿色荧光弥散在整个细胞质中的此前两万多个样品不同，在这个小孔中绿色荧光信号仿佛被磁铁吸附了一样，汇聚成了一簇簇光点。在漆黑一片的背景下，好像是夜空中一颗颗闪亮的明星，散发出迷人的光亮。
大半年阴性结果笼罩的探索黑夜，此刻终于浮现出了点点星光。
这个突变体出现在筛选的366号板编号为c7的小孔中，因此许悦将这个突变体命名为366-c7。
366-c7突变体的表型非常有趣：野生型的沙门氏菌侵染细胞时，只能比较微弱地引发细胞异源自噬通路的激活，因此gfp-lc3的荧光信号总是弥漫在细胞质中；366-c7突变菌侵染细胞，却会引发gfp-lc3的聚集，表明宿主细胞的异源自噬通路大幅度增强，说明366-c7株系很可能是一个细菌中原本会抑制宿主细胞异源自噬通路激活的基因发生了突变。
利用分子生物学技术，许悦很快鉴定出366-c7突变体在基因组中插入的位置：一个编号为sl1344_1177的基因被破坏。1177代表这是该沙门氏菌株系的第1177个基因，对于这个基因，ncbi数据库中只显示它包含了374个氨基酸。至于结构和功能，当时还没有任何记载。
看来是挖到宝了。许悦心中窃喜。
进入前人没有踏足过的荒地，对于胆小者而言是前途未卜避犹不及的穷山恶水，但对于真正的勇者，却是大展身手封狼居胥的良田沃土。
紧接着完成了的1177号基因的定向突变和回补实验的结果，进一步巩固了她的猜想：1177号基因是一个全新的沙门氏菌触发自噬通路的抑制因子。并且它是沙门氏菌iii型分泌系统的效应蛋白，可以直接进入真核细胞中发挥功能。
邵老师后来决定将这个基因命名为sebx，代表沙门氏菌中抑制异源自噬的效应分子（salmonella effector blocking xenophagy）。更有意思的是，sebx对其他细菌引起的自噬同样具有抑制效果，但对于已经研究得非常清楚的经典自噬通路却没有影响。
图3. sebx突变体的表型。与其他突变体相比，366-c7突变体（右上）中gfp-lc3呈现明显聚集状态。许悦经过基因定位发现这个突变体是一个以前从未被报道过的基因发生了突变，最初将它命名为sebx。
2014年的4月，许悦正式成了第一个发现沙门氏菌编码抑制异源自噬蛋白的人。但还没来得及庆祝，她很快就陷入了这片新大陆上迷雾与泥沼的重重包围之中。
迷雾（2014.4-2015.1）
sebx抑制异源自噬的机制是什么？这是横亘在许悦面前的重要问题。要想回答这个问题，按照常规的思路一般会从两个方面入手：
第一，大多数细菌效应蛋白都是酶，也就是说能催化生物体内特定化学反应的高效发生。因此，许悦前进的一个方向是去探寻sebx在细胞内所能催化的生化反应，即尝试去找到这个蛋白的酶学活性。
第二，假若sebx有酶活性，还可以通过寻找与它存在相互作用的蛋白组分，鉴定出它所催化的反应的底物，进而更好地理解它作用的机制。
但在当时，还没有一篇对于sebx的研究记载，看来前人从未对这个蛋白有过研究。缺乏线索的许悦此刻仿佛身处在一团迷雾之中。
基于自噬通路中已阐明的机制以及邵峰团队过往研究细菌效应分子的丰富经验，许悦提出了关于sebx可能作用机制的七种假设，仿佛是制作了七条锦囊妙计，并逐一设计实验对其进行验证。
七个锦囊逐一被许悦拆开了——她用严谨扎实的实验数据将自己此前所作出的假设一一推翻。
“看来我们已经积攒了七个supplementary的数据。”邵老师在与许悦讨论阴性实验结果时开着玩笑说道。
大半年的时光在拆锦囊的过程中无声无息地流走了，许悦的课题在迷雾中兜了七个圈子，最终还是回到了原地。
联手（2015.1-2016.4）
我必须承认，幸运喜欢照顾勇敢的人。 查尔斯·达尔文（1809-1882）
周平博士是在2015年年初的时候参与到许悦的课题研究中的。周平在华中农业大学刘榜教授实验室获得博士学位，博士期间用转录组学方法对猪呼吸道病毒感染肺部巨噬细胞的机制进行研究。怀着对天然免疫系统的强烈兴趣，他在2012年作为博后加入了邵峰实验室。
可是，四周雾气这么重，他们怎么才能打开研究的突破口呢？
“当研究没有什么头绪的时候，就去做个筛选吧。”邵峰老师云。
希望再一次寄托在遗传学筛选这张看上去无所不能的神奇大网上。
但是，与对细菌进行遗传筛选不同，对哺乳动物进行遗传筛选更加困难。真核细胞是二倍体，而且基因组中真正编码蛋白质的比例仅占全基因组序列的1%左右。在21世纪的第一个十年里，基于rna干扰技术对哺乳动物细胞作遗传学筛选是当时技术限制下最好的方法，但依然困难重重。
但就在许悦博士一年级期间，生物学领域所发生的一项历史性突破，大大降低了哺乳细胞遗传筛选的难度。
2013年初，麻省理工学院的张锋团队报道了crispr/cas9系统可以对真核细胞的基因组进行高效编辑，并且很快设计出几乎覆盖全基因组的grna文库。周平博士的工作内容之一便是在这一技术的基础上，设计crispr/cas9遗传筛选体系，寻找参与异源自噬的关键基因[4, 5]。
可是由于课题的特殊性质，建立回答这个特定问题的crispr遗传筛选系统的道路注定充满荆棘：利用crispr系统进行遗传筛选的原理，是希望能通过某一表型将感兴趣基因被敲除的细胞与其他基因敲除的细胞分开，再通过对基因组文库进行测序通过grna的富集将感兴趣的基因找出来。这个表型需要足够强，比如细胞的死活是crispr筛选系统被最常使用的判断表型——假如研究者想研究癌细胞对化疗药产生抵抗的机制，就可以用药物去杀伤癌细胞，没被杀死的癌细胞很可能就是在化疗药作用的通路上的基因被敲除，进而可以免疫药物的杀伤。
那么该如何设计实验，才能将发生异源自噬和不发生异源自噬的宿主细胞区分开呢？
gfp-lc3的荧光信号在细胞内的分布变化可以是反映异源自噬水平的标志：许悦当初发现366-c7，就是观察到异源自噬水平强的细胞中gfp-lc3聚成了一簇簇明亮的小团，而异源自噬水平低的细胞中gfp-lc3是弥散在整个细胞质中的。
但存在一个很大的问题：gfp-lc3荧光信号在亚细胞水平分布上的差异可以在显微镜下通过人眼分辨，但一次遗传学筛选要考察上亿个细胞的gfp-lc3荧光信号分布差异，仅凭周平和许悦两双眼睛来看，恐怕花上几十年也看不完。
流式细胞仪可以基于细胞荧光强度的不同，以每秒钟上万个细胞的速度对细胞进行分选，看上去是一个不错的解放人力的方案。
但是问题来了：一般流式细胞仪只能测量出每个细胞整体的荧光强度，但对于细胞来说，异源自噬水平高低差异，仅仅体现在绿色荧光信号的分布上，在整个细胞水平，荧光信号强度并没有出差异。也就是说：低通量人眼能辨别的差异，高通量的仪器觉察不出来。
遇到如此大的困难，不如就此放弃了吧？
这个时候，周平博士对问题进行了仔细的思考：他想，流式细胞仪区分不出细菌自噬水平不同细胞的本质，是一个关于信噪比的问题。对于细菌自噬水平高的细胞而言，有效的信号其实是在膜泡上聚集成团的gfp-lc3，散布在细胞质中的gfp-lc3是干扰检测的背景噪音；在细菌自噬水平低的细胞中，弥散在细胞质中的“噪音”实在是太强了，以至于鸠占鹊巢，掩盖了希望检测的信号。因此，要想帮助仪器辨别出两类细胞的差异，关键需要在提高信噪比方面下功夫。
提高信噪比，一种思路是提升信号本身强度，另一种是降低背景信号。为了实现第一点，周平博士首先在细菌中表达了一类黏附分子afa，使得细菌能通过结合宿主细胞表面分子cd55，粘在细胞表面，从而使得更高比例的细菌能进入细胞感染，更多的细胞的细菌自噬通路被激活，从而观察到更多的细胞出现结团的绿色荧光信号。
如何才能降低细胞质中荧光信号背景呢？周平从物理化学的角度进行思考：聚团的gfp-lc3和弥散的gfp-lc3不同之处在于，前者经过脂质修饰，附着在膜上，而后者水溶性较强。基于这一本质上的差别，周平博士萌生了一个精巧的想法：假若能用一种试剂，在细胞膜上打一些小孔，让水溶性的gfp-lc3流出，细胞中只留存脂溶性的聚团的gfp-lc3，如此处理过后的两类细胞荧光信号强度的差异，不就能被流式细胞仪识别了吗？
基于2010年瑞典卡罗林斯卡医学院mcinerney实验室的一篇报道，周平博士用一种比较弱的去垢剂——皂苷（saponin）——处理细胞，惊喜地发现这种方法能将背景降到足够流式细胞仪分辨两组细胞的程度[6]。如此处理过后，似乎就能通过流式细胞仪将感兴趣的少数异源自噬通路被抑制的细胞从大量异源通路正常被激活的细胞中分选出来，进而通过研究这些细胞中grna的富集程度，推断细胞中哪些基因的破坏会导致异源自噬通路的抑制。
找到了看上去如此理想的条件，周平迫不及待地展开了第一轮筛选。
然而经历了忙碌的两个月，当看到测序分析的结果后，周平和许悦都有点失望：按照他们原先的设想，在异源自噬通路被抑制的细胞中，应该能检测到那些此前已知的参与到异源自噬过程的基因，现实却是，他们并没有观察到这些阳性对照grna的富集。
本来冀望通过撒网的方式希望能寻找突破口，可忙活了半天拿到结果之后才发现，自己在用的原来是一张破网。
换句话说，就是实验的结果非常糟糕，遗传筛选的体系还需要进一步优化，这次筛选得到的候选基因没有任何科学意义。
为什么筛选会失败？周平很快从失落中调整过来，对原始数据进行冷静的思考。他发现，当前的方法主要存在两个很大的问题：第一，gfp-lc3信号的强度是连续的，因此在流式细胞仪上如何划分选择的界限，是一个容易因为主观因素引入偏差的步骤；其次，使用表达afa的菌株进行侵染，固然提升了侵染效率，但同时由于在gfplow细胞亚群中依然存在大量未发生异源自噬的假阳性细胞，严重影响了筛选的质量。
在把网再次撒出以前，得把这张网上的漏洞一一补牢才行。补网的第一步，是希望能找到一个客观的划分绿色荧光阈值的标准。周平博士绞尽脑汁，想到了一个绝好的参照系，即将携带了另一种红色荧光蛋白不经历grna文库敲除、同时异源自噬下游一个关键效应基因atg5敲除的对照细胞从细菌侵染的步骤开始就与实验组细胞混在一起处理，作为划界的标准。
接下来挑战第二个漏洞——如何才能降低假阳性细胞的干扰呢？经过冷静的分析，周平发现，问题的关键出在那些表面黏附有细菌、但实际又没有被细菌感染的那些细胞，只要在实验中将这部分细胞清除掉，就可以很好地降低假阳性的风险。
训练有素的生物学家在解决技术问题时，会去思考实验背后的生物化学原理。
周平心想，细菌粘附在细胞表面，本质上是细菌的afa蛋白与细胞膜上的cd55之间的非共价相互作用。假若能在细菌侵染之后、细胞分选之前增加一步特殊处理，破坏afa与cd55之间的作用，洗脱细胞表面粘附的细菌，是不是就可以通过细胞中细菌荧光蛋白的信号作为分界线消除这部分来自假阳性细胞的干扰呢？
于是，周平尝试了一系列能使蛋白质变性的物质，最终发现，乙醇处理能显著降低假阳性细胞的比例。
2016年4月1日，经历了一年多反复的试错，周平博士打开了第五轮优化筛选的测序分析结果——筛选质量极高，异源自噬通路已知的阳性对照基因纷纷从两万多个基因中被拎出了队伍。筛选总共发现了87个候选基因可能与异源自噬通路相关。
他们欣喜地感受到，身边足足纠缠了两年的浓雾终于稍有消散，露出了一些可以继续前进的道路。
图4. 艰难的crispr遗传筛选。为了找到宿主细胞中参与异源自噬的基因，周平博士开展了一个全基因组的遗传学筛选。由于所要回答科学问题的特殊性，这个遗传筛选体系的建立经历了很多波折。
花明（2016.4-2016.12）
许悦和周平在得到遗传筛选结果后做的第一件事，就是验证筛选的结果，他们针对每一个候选基因单独设计了多条grna，同时与cas9蛋白转染细胞，快速检验敲除该基因是否能重现筛选的表型，即是否会下调异源自噬水平。测验的结果是，大多数的小道都是死胡同，单独敲除该基因没有表型。
除了已知阳性对照基因以外，只剩下五个基因结果可被重复：atp6ap1, atp6ap2, atp6v1f, atp6v0c, atp6v1h。
这五个基因其实都是编码是细胞中同一个复合物的组成亚基，而这个复合物则是一个在生物化学领域名气非常大的蛋白——v-atpase。
v-atpase是一个蛋白复合物，就像是一台离子泵，通过水解atp分子获得转动的能量，将氢离子从氢离子浓度低的细胞质泵到浓度较高的膜泡中。
但对于v-atpase复合物可能参与异源自噬过程的这个发现，许悦却感到喜忧参半。
喜的是，可靠的遗传筛选结果加上一连串跟进的验证实验，她对于v-atpase在异源自噬事件中的必要性成竹在胸，这一点此前从未有人报道过；忧的是，v-atpase是一个对细胞生存至关重要的膜蛋白复合物，研究起来技术上存在很大的挑战。此外，在机制上如何能将v-atpase从其众多功能中区分出来，与异源自噬联系在一起，她还没有一点头绪。
茨威格在《人类群星闪耀时》中曾写道，在某一个特定瞬间，一个人会被历史的进程推到一个特别的地方，在那里见到前人不曾见过的壮丽景色。茨威格写这句话的背景，是在形容横穿美洲大陆看到一望无际的太平洋时刻的探险家巴尔博亚，以及一夜天才写出不朽杰作《马赛曲》的鲁日。
但在科学探索的道路上，经过艰苦跋涉、冲破重重险阻之后，忽然的灵光一现，将过往的数据整合在一起、将逻辑链条串联通顺的刹那，大脑中仿佛一道闪电划过漆黑的夜空，一切都变得豁然开朗，研究者从中收获的快乐和满足可能不逊于茨威格笔下那些英雄们。
2016年5月的一天，许悦在分析一份新鲜出炉的质谱数据时，就经历了类似于两千多年以前一位古希腊先哲高呼“eureka”的高光时刻。
早在2015年年初周平开始摸索crispr遗传筛选条件的同时，许悦没有停下探索的脚步。基于当时已有的线索，她在人细胞系上构建出多个和自噬相关的基因敲除细胞系，并尝试借此探究哪些基因可能参与到异源自噬的过程。在自噬通路中的atg16l1基因敲除与截短体回补实验中，她发现atg16l1的wd40结构域参与异源自噬过程，但对于经典自噬通路不重要。不过这个发现没有让课题有突破性进展，因为经过反复的实验，没有结果将sebx与atg16l1联系在一起。
在确认v-atpase参与到异源自噬之后，许悦试图通过在v-atpase结合的蛋白中寻找一点继续做下去的草蛇灰线。她严谨地设计了平行对照与实验组，选取其中一个亚基进行免疫共沉淀。当拿到质谱结果时，许悦扫了一下清单，丰度最高的蛋白都是v-atpase复合物中的成分，这都在预料之中。但随着清单的下拉，她的视线突然定格在了 “atg16l1”，想不到这个熟悉的蛋白竟会在细菌感染的实验组中出现。在确认atg16l1在阴性对照组渺无踪迹之后，一阵狂喜涌上心头——是了，众里寻他千百度，联系v-atpase与异源自噬之间的关键蛋白原来就是atg16l1！逻辑链条上关键的一环终于被扣上了。
图5. 激动人心的eureka时刻。当许悦看到这一质谱结果时，立刻想通了v-atpase与自噬通路的联系。atg16l1仅在病原体自噬通路激活的细胞中可以被v-atpase富集检测到，说明v-atpase很可能是通过atg16l1触发了病原体自噬通路。
接下来的两个月里，许悦一鼓作气，最终论证出atg16l1利用wd40结构域与v-atpase复合物发生直接相互作用。
还记得在刚刚找到sebx时许悦曾试图寻找它的酶活性质但始终毫无进展吗？
这条道路的探索此时也出现了一点新的眉目。
在许悦和周平在忙乎着优化crispr遗传筛选的同时，与邵峰实验室长期合作的中科院生物物理所的副研究员丁璟珒博士主动请缨，试图解析sebx的结构。一个神来之笔的截短改变，帮助丁璟珒博士成功获得了sebx的晶体，并在2016年的年底解出了sebx晶体结构。sebx的结构提示它可能是一个adp-核糖转移酶。很快许悦也通过体外的实验检测到了sebx能促进nad 的水解，说明sebx极有可能具有adp-核糖转移酶活性，支持基于结构作出的推测。
到了2016年底，博士五年级的许悦几乎收集齐了讲出一个震惊整个异源自噬领域故事的全部资料。
此时，距离整个故事逻辑链条的完善，只差一块拼图。
2016年底的许悦斗志昂扬，士气高涨。那时的她绝不会想到，为了这最后一块拼图的嵌入，她将在接下来的将近两年里继续经历煎熬。
科研论文的发表，是对科研工作者辛勤努力的丰厚奖赏，但其中也充满了遗憾：当代科研论文为了保证逻辑的通顺，发表时的行文顺序与研究者实际开展研究的顺序往往大相径庭——对于作者来说，论文中一句简简单单的过渡，背后可能藏着道不尽的呕心沥血与辛酸苦涩；而对于读者，阅读一篇逻辑缜密的科学论文，固然能高效地获取相关领域的最新知识，但同时却错过了论文背后作者在探索未知道路上摸爬滚打的历程，实在是极大的损失。
“科研外史”系列文章希望能在论文作者和读者之间搭建一个桥梁，让作者有机会在这里分享科研路上看到奇伟瑰丽景色时的那份欢喜，以及在实验陷入停滞时内心跌入深渊谷底的绝望与挣扎；对于读者，了解论文发表背后曲折的探索故事，一方面能从作者克服困难的经验中学习，积累科学研究的方法论，在未来自己遇到类似困难时能有更出色的应对。但更重要的是，希望借助“科研外史”系列，读者们能够从一篇篇优雅精致的论文背后，看到一个个有血有肉的科学家——他们有着自己的喜怒哀乐，在课题有进展时会感到喜悦，在遇到瓶颈时会失望郁闷。他们平凡，可能只是等车时我们身边的一个普通路人；他们卓越，是因为在某一些特别的时刻，正是他们坚忍不拔、永不言败的精神，开拓着全人类自然科学知识的边疆。
欢迎你也将自己或者周围人的科研探索故事与我们分享！
